間充質干細胞是干細胞家族的重要成員，具有高度增殖、自我更新能力，廣泛分布于骨髓、臍帶血、臍帶、胎盤、脂肪、外周血及肌肉等各種組織中。Exosomes中義名稱為外來體或外泌體，是一種脂質分子膜包裹的小囊泡，是胞外囊泡（exracellular vesicles）的一種，外泌體中包裹多種活性分子，如活性蛋白、RNAs（IncRNA、mcroRNA.、mRNA等）及DNA等。干細胞的外泌體可以對組織進行損傷修復、抑制炎癥反應、調節免疫系統等，目前被研究于多種疾病模型中，如減少心肌梗死的面積，促進腎臟的損傷修復，調節免疫應答等。本論文主要就早產新生兒臍帶內分離獲得的間充值干細胞外泌體的相關性質進行研究，研究這類細胞外泌體進行。


微電極的應用


使用了unisense的微電極測試了MSC外泌體細胞的氧氣呼吸速率情況。在測試細胞的氧氣消耗前，所應用的電極經過矯正平衡，并獲得標準曲線，其中細胞的呼吸速率是以nmmol/min/mg單位表示。


實驗結果


間充值干細胞（MSCs）是干細胞家族的重要成員，具有高度增殖、自我更新能力、廣泛分布于骨髓、臍帶血、臍帶、胎盤、脂肪、外周血及肌肉等各種組織中。本論文研究分析早產兒與足月兒臍血分離的間充質干細胞外泌體的氧化磷酸化性能是應用流式細胞儀、免疫印跡法、血樣定量法和熒光分析法進行鑒定的。在使用Unisense微電極系統測試MSCs外泌體線粒體呼吸鏈復合物表達過程中的氧氣消耗情況時候發現，ATP合成酶能夠在足月新生兒的臍帶提取MSC外泌體中檢測到。MSC外泌體在不需要線粒體的情況下具有特定的有氧呼吸能力。

圖1、流式細胞儀檢測足月兒和早產兒的UCB-MSCs表面標記。其中的MSC細胞是足月新生兒胚胎提取的間質干細胞（MSC）和早產新生兒胚胎提取的間質干細胞。從圖中可以看出，不論是足月的還是早產兒臍帶提取的MSC細胞表面對CD73、CD105、CD90等表達特異性標志物均表現為陽性，而對于CD41、CD 34、CD14均呈現陰性，這說明表達了典型間充質干細胞標記CD73、CD90和CD105，均不表達造血干細胞標記CD34，CD45、CD14。

圖2、從UC MSC實驗中分離出足月和早產兒臍帶提取的干細胞的外泌體的氧化磷酸化性質研究。圖A、B指的是正常臍帶提取的干細胞外泌體以及早產兒臍帶提取的干細胞外泌體的氧消耗分析。這兩組細胞外泌體的呼吸作用會隨著NADH以及琥珀酸鹽的加入而增強，而魚藤酮和抗酶素的加入會抑制其細胞的呼吸。其中的氧氣消耗是以umol為單位。圖C表示的是對比MSC線粒體（白色空心柱）、早產新生兒臍帶提取MSC外泌體（灰色柱）、正常新生兒臍帶提取MSC外泌體（淡灰色柱）、使用尼日利亞菌素處理過的早產新生兒臍帶提取MSC外泌體（斜線柱）、使用尼日利亞菌素處理過的正常新生兒臍帶提取MSC外泌體（黑色柱）的呼吸速率，其中的氧氣呼吸速率的單位是nmol O/min/mg。圖D指的是這些細胞線粒體在進行正常呼吸代謝時的ATP生產對比。圖E指的是MSC線粒體、正常新生兒臍帶提取MSC外泌體線粒體以及早產新生兒臍帶提取MSC外泌體線粒體進行呼吸代謝過程的電子轉移情況分析。上述實驗，每組數據都是測試5次獲得的平均數據。

圖3、蛋白的氧化磷酸化表達評價，采用了免疫印跡法。圖A指的是使用免疫印跡法（WB）分析ATP的合成酶以及來自于早產兒和正常足月新生兒臍帶分離獲得的MSC外泌體細胞中線粒體呼吸鏈復合物的凝膠電泳圖像分析。圖B表示的是上述外泌體中線粒體呼吸鏈復合物（NADH-Q氧化還原媒（也稱為復合物I）、細胞色素C氧化酶（也稱為復合物IV）ATPase(ATP合成酶復合物V)）表達的密度分析。圖C指的是二維細胞培養法獲得的正常新生兒臍帶提取的外泌體的二維凝膠電泳圖像（經過銀染色）。圖D指的是使用紅色染色后的外泌體膜外的表面蛋白表達的二維凝膠電泳圖像。圖E指的是免疫印跡法分析ATP合成酶的β-表面蛋白抗體分析的凝膠電泳圖像。


總結


人臍血是指臍帶內及胎盤近胎兒一側血管內的血液，研究顯示其除含有豐富的造血干細胞外，還含有其他的干/祖細胞，包括間充質干細胞、內皮祖細胞等。本論文研究了間充值干細胞外泌體的相關性質。通過對早產兒與足月兒臍帶血提取分離獲得相應的間充質干細胞外泌體。臍帶間充質干細胞來源的外泌體可以通過改善氧化應激反應及抑制凋亡而保護腎臟免受四氯化碳誘導的損傷。干細胞來源的exosomes在組織重建上起到了很重要的作用，其在再生醫學方面得到了廣泛的實驗研究。本論文應用了流式細胞儀分析外泌體細胞進行了UCB-MSC表面標記，并且應用Unisense微電極系統測試了外泌體在進行氧化磷酸化過程中的線粒體呼吸鏈酶電子轉移過程中的氧氣消耗情況，從而得出了MSC外泌體在沒有線粒體的情況下也能進行有氧代謝，這也進一步說明了，使用微電極系統可以很好的發揮MSC干細胞外泌體在治療組織損傷、皮膚修復、神經系統疾病方面存在著廣泛的應用。